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細(xì)胞瞬時轉(zhuǎn)染原理及實驗步驟

更新時間:2021-06-04點擊次數(shù):2889

       細(xì)胞復(fù)蘇


       細(xì)胞復(fù)蘇是將保存在液氮或-80℃冰箱中的細(xì)胞株解凍并重新培養(yǎng)的過程。細(xì)胞復(fù)蘇的關(guān)鍵是快速。防止在解凍過程中,產(chǎn)生的水珠形成冰晶損傷細(xì)胞。細(xì)胞復(fù)蘇一般步驟如下:

       1. 預(yù)先加熱水浴鍋,溫度至 37-40℃,并在離心管中準(zhǔn)備好 10mL 培養(yǎng)基

       2. 從液氮罐或冰箱中取出細(xì)胞,迅速放進(jìn)預(yù)熱的水浴鍋中,鑷子夾住凍存管晃動,使其受熱均勻

       3. 當(dāng)凍存管內(nèi)*融化時,注意用酒精擦拭凍存管消毒,將液體倒入含有 10mL 培養(yǎng)基的離心管中

       4. 離心 5min,去除上清,得到沉淀

       5. 用培養(yǎng)基懸浮沉淀,并接種到培養(yǎng)瓶常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)

       細(xì)胞復(fù)蘇后,生長一段時間,95%的細(xì)胞貼壁生長,細(xì)胞狀態(tài)良好,說明細(xì)胞復(fù)蘇成功。

       

       瞬轉(zhuǎn)步驟


       以 Lipofectamine 轉(zhuǎn)染試劑為例的操作流程,不同轉(zhuǎn)染試劑參考說明書

       1. 將復(fù)蘇后常規(guī)培養(yǎng)的細(xì)胞按照 1-3x105 接種到 6 孔板中,加入 2-4mL 的*培養(yǎng)基,混勻放置在氣套式二氧化碳培養(yǎng)箱中 37℃過夜

       2. 無菌狀態(tài)下配置如下溶液:

       a 用 100ul 的無血清培養(yǎng)基稀釋 2ug 的待轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒

       b 用 100ul 的無血清培養(yǎng)基稀釋 25ul 的 Lipofectamine 轉(zhuǎn)染試劑(血清的存在會影響細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率,因此要使用無血清培養(yǎng)基轉(zhuǎn)染)

       3. 將 ab 溶液混合并搖勻,室溫下放置 30min 左右

       4. 細(xì)胞培養(yǎng)至 80%單層左右,用無血清培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞 2 次,每孔加入 1mL 的無血清培養(yǎng)基,并將混合后的 ab 溶液逐滴加入到每孔,按十字方向輕搖混勻,氣套式二氧化碳培養(yǎng)箱中 37℃培養(yǎng) 24 小時

       5. 將轉(zhuǎn)染液倒出,換為*培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng),培養(yǎng) 3-4 天后檢測蛋白表達(dá)量



       轉(zhuǎn)染檢測

       收集培養(yǎng)的細(xì)胞,采用超聲或酶解的方法破碎細(xì)胞,離心得到上清。轉(zhuǎn)染后的檢測主要包括基因水平和蛋白水平的檢測。針對基因水平,使用普通 PCR 或 RT-PCR 進(jìn)行驗證,或可使用先達(dá)基因ERA法進(jìn)行檢測,簡單,快速,準(zhǔn)確。蛋白水平,使用 western blot 檢測。

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