初發(fā)酵實(shí)驗(yàn) 發(fā)酵管內(nèi)裝有單倍或三倍乳糖蛋白胨培養(yǎng)液，并在內(nèi)倒置有小玻璃管。每個(gè)樣品用三個(gè)不同的水樣量接種，同一接種水樣量要有五管，將水樣分別接種到裝有乳糖蛋白胨培養(yǎng)液的發(fā)酵管中，在37℃±0.5℃下培養(yǎng)24h±2h。乳糖能起選擇作用，因?yàn)楹芏嗉?xì)菌不能發(fā)酵乳糖，而大腸菌群能發(fā)酵乳糖并產(chǎn)酸產(chǎn)氣???培養(yǎng)液中加入溴甲酚紫作為酸度指示劑，細(xì)菌產(chǎn)酸后，培養(yǎng)液即由原來(lái)的紫色變成黃色。產(chǎn)酸產(chǎn)氣的發(fā)酵管表明試驗(yàn)陽(yáng)性，如在倒管內(nèi)產(chǎn)氣不明顯，可輕拍發(fā)酵管，有小氣泡升起為陽(yáng)性。

    復(fù)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)輕微振蕩初發(fā)酵試驗(yàn)陽(yáng)性結(jié)果的發(fā)酵管，用3mm接種環(huán)將培養(yǎng)物(2-3環(huán))轉(zhuǎn)接到EC培養(yǎng)液中，在44.5℃±0.5℃下培養(yǎng)24h±2h(提高培養(yǎng)溫度可造成不利于來(lái)自自然環(huán)境的大腸菌群的生長(zhǎng))。培養(yǎng)后立即觀察，發(fā)酵管產(chǎn)氣則證實(shí)為糞大腸菌群陽(yáng)性。

    2.濾膜法

    濾膜是一種微孔性濾膜，孔徑0.45μm。將水樣注入已滅菌的放有濾膜的過(guò)濾器中，經(jīng)過(guò)抽濾，細(xì)菌即被截留在膜上，然后將濾膜貼于M-FC培養(yǎng)基上，在44.5℃±0.5℃下培養(yǎng)24 h±2h。糞大腸菌群菌落在M-FC培養(yǎng)基上呈藍(lán)色或藍(lán)綠色，其他非糞大腸菌群菌落成灰色、淡黃色或無(wú)色。正常情況下，由于溫度和玫瑰酸鹽試劑的選擇性作用，在M-FC培養(yǎng)基上很少見到非糞大腸菌菌落。

    二.兩種方法的注意事項(xiàng)

    1.培養(yǎng)溫度的要求 總大腸菌群中的細(xì)菌除生活在腸道中外，在自然環(huán)境中的水與土壤中也經(jīng)常存在，但此等在自然環(huán)境中生活的大腸菌群培養(yǎng)的zui合適溫度為25℃左右，如在37℃培養(yǎng)則仍可生長(zhǎng)，但如將培養(yǎng)溫度再升高至44.5℃，則不再生長(zhǎng)，而直接來(lái)自糞便的大腸菌群細(xì)菌，習(xí)慣于37℃左右生長(zhǎng)，如將培養(yǎng)溫度升高至44.5℃仍可繼續(xù)生長(zhǎng)。因此，可用提高培養(yǎng)溫度的方法將自然環(huán)境中的大腸菌群與糞便中的大腸菌群區(qū)分，兩種方法也都基于此理。將接種好的樣品或裝有濾膜的培養(yǎng)基放入生化培養(yǎng)箱時(shí)，箱內(nèi)溫度一定要達(dá)到所要求的溫度(44.5±0.5℃)時(shí)，方可放入。如用恒溫水浴箱時(shí)，其水面要高于接種物面，放濾膜的培養(yǎng)皿要沉到水浴箱底部。

    2.加氯水樣的處理 經(jīng)氯處理消毒過(guò)的水樣，水中含有一定量的余氯，使大腸菌群處于受損或受抑制狀態(tài)，在采集水樣時(shí)應(yīng)提前在采樣瓶中加硫代硫酸鈉，硫代硫酸鈉可以脫氯，使受損的細(xì)菌得以復(fù)蘇與修復(fù)，從而避免出現(xiàn)計(jì)數(shù)結(jié)果偏低甚至假陰性的現(xiàn)象。此外余氯對(duì)濾膜法培養(yǎng)的細(xì)菌其抑制作用尤為明顯，所以抽濾時(shí)應(yīng)對(duì)水樣進(jìn)行大量無(wú)菌水稀釋，以減少余氯的殘留。

    3.樣品的保存采樣用的容器使用前應(yīng)蓋好瓶蓋，用牛皮紙將瓶蓋和瓶頸處包裹好，置干燥箱160℃-170℃干熱滅菌2h，或用高壓蒸汽滅菌器121℃滅菌15min。采樣后水樣的正確保存也很重要，如保存不當(dāng)可使樣品中的大腸菌群細(xì)菌死亡或在一定條件下再生長(zhǎng)，這些都將影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。檢測(cè)室接到水樣后，應(yīng)立即檢測(cè)，如因故不能檢測(cè)時(shí)，應(yīng)立即將樣品置于冰箱內(nèi)(2℃-10℃)并于2小時(shí)內(nèi)檢測(cè)。

    4.培養(yǎng)物質(zhì)的制備與保存

    ⑴.多管發(fā)酵法所使用的培養(yǎng)液在分裝于各發(fā)酵管中后，應(yīng)將發(fā)酵管盡快放于高壓蒸汽滅菌器中，在115℃滅菌20min(注意：這個(gè)溫度也應(yīng)控制好，既達(dá)到滅菌的作用，還要防止培養(yǎng)物質(zhì)分解流失)，然后貯存于冰箱或暗處備用。

    ⑵.濾膜法所采用的M-FC培養(yǎng)基多使用外購(gòu)的成品，培養(yǎng)基中苯胺藍(lán)的純度和質(zhì)量往往影響菌落的顏色，因此，無(wú)菌包裝的成套培養(yǎng)基在使用前，先接種典型糞大腸菌，以觀察對(duì)比菌落的顏色，來(lái)鑒定其穩(wěn)定性。

    5.結(jié)果統(tǒng)計(jì)

    ⑴.多管發(fā)酵法的結(jié)果是根據(jù)不同接種量的發(fā)酵管所出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果的數(shù)目，從MPN表中查得相應(yīng)的MPN指數(shù)，來(lái)計(jì)算每升水中糞大腸菌群細(xì)菌的MPN值。MPN是“Most Probable Number”的縮寫，指zui大可能數(shù)，它是根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)理論，估計(jì)水體中的菌群密度和衛(wèi)生質(zhì)量的一種方法，所以準(zhǔn)確判斷不同接種量發(fā)酵管的陽(yáng)性數(shù)是非常重要的，否則將導(dǎo)致較大偏差。

    ⑵.濾膜法的結(jié)果是計(jì)數(shù)濾膜上呈藍(lán)或藍(lán)綠色的菌落，來(lái)計(jì)算出每升水樣中的糞大腸菌群數(shù)。所以為便于計(jì)數(shù)，減少誤差，理想的水樣體積是一片濾膜上生長(zhǎng)20-60個(gè)糞大腸菌群菌落。